يتطلب التأكيد الهيكلي للصوديوم الهيالورونات المربوط بالأحماض الأمينية (حمض الهيالورونيك، HA) توصيفًا شاملًا من خلال تقنيات تحليلية متعددة لتحديد موقع الربط المتقاطع، ودرجة الربط المتقاطع، والجزيئية.
تغير الوزن وسلامة البنية الكيميائية. فيما يلي الخطوات والأساليب التفصيلية:
1. تنقية العينة والمعالجة المسبقة.
غسيل الكلى/الترشيح الفائق: إزالة الأحماض الأمينية غير المتفاعلة، وعوامل الترابط، والمنتجات الثانوية ذات الجزيئات الصغيرة.
التجفيف بالتجميد: للحصول على عينات جافة لتحليلها لاحقًا.
2. تأكيد الهيكل الكيميائي
(1) طيف الأشعة تحت الحمراء (FT-IR)
الغرض: تأكيد تشكيل روابط الترابط (مثل روابط الأميد، وروابط الإستر).
القمم المميزة:
هيالورونات الصوديوم: كربوكسيلات (COO⁻، ~1600 سم-¹ و~1400 سم-¹)، هيدروكسيل (~3400 سم-¹).
بعد الترابط العابر للأحماض الأمينية: نطاق أميد I جديد (C=O، ~1650 سم-1)، نطاق أميد II (N-H، ~1550 سم-1) أو رابطة الإستر (C-O).
يتم إضافة (، ~1730 سم⁻¹).
(2) رنين مغناطيسي نووي (NMR)
H NMR و C NMR:
اكتشف إشارات البروتون/الكربون للهيكل العظمي لـ HA (حمض الجلوكورونيك و N-acetylglucosamine).
تأكد من قمم الخصائص للأحماض الأمينية (مثل α-H، مجموعات السلسلة الجانبية).
إشارات روابط العابرة (مثل روابط الأميد أو روابط الإستر التي تم تكوينها حديثًا).
NMR ثنائي الأبعاد (COSY، HSQC، HMBC): يساعد في تعيين مواقع الروابط العابرة.
(3) قياس الكتلة (MS)
MALDI-TOF MS أو ESI-MS:
قم بقياس تغير الوزن الجزيئي قبل وبعد الترابط العابر للتحقق من درجة الترابط العابر.
اكتشف أي شظايا تدهور أو منتجات ثانوية محتملة.
3. تحليل درجة الربط العابر والوزن الجزيئي.
(1) تحديد درجة الربط العابر
طريقة TNBS (حمض ترينيتروبنزين سلفونيك): تحديد كمية مجموعات الأمينو الحرة غير المتفاعلة وحساب درجة الترابط بشكل غير مباشر.
تحليل عنصري: قم بتقييم كمية الحمض الأميني التي تم إدخالها بسبب التغيير في محتوى النيتروجين.
(2) توزيع الوزن الجزيئي
كروماتوغرافيا نفاذية الهلام (GPC/SEC):
استخدم تقنية تشتت الضوء متعددة الزوايا (MALS) للكشف عن الوزن الجزيئي المطلق.
قارن التغييرات في الوزن الجزيئي والتوزيع قبل وبعد الترابط.
4. توصيف الحراري والمورفولوجي
(1) قياس الحرارة التفاضلي (DSC)
اكتشف التغيير في درجة حرارة التحول الزجاجي (Tg) بعد الترابط، مما يعكس تقييد حركة السلسلة الجزيئية.
(2) تحليل الحرارة الوزنية (TGA) يقيم الاستقرار الحراري. عادة ما يزيد الترابط من درجة حرارة التحلل.
(3) فحص المجهر الإلكتروني (SEM)
لاحظ المورفولوجيا المجهرية بعد الترابط (مثل البنية النفاذة أو الشبكة الكثيفة).
5. تحقق بيولوجي ووظيفي
(1) ثبات الإنزيم
علاج بالهيالورونيداز ومقارنة معدل التحلل قبل وبعد الترابط.
(2) خصائص التورم
قم بتحديد معدل التورم المتوازن للهيدروجيل المشبع ليعكس كثافة شبكة الربط العابرة.
6. تقنيات مساعدة أخرى
حيود الأشعة السينية (XRD): تحليل التغيير في بلورة (غالبًا ما يؤدي الربط العابر إلى عدم التبلور).
طيف رامان: تأكيد إضافي لمعلومات الروابط الكيميائية.
الوسم الفلوري (إذا كانت الأحماض الأمينية تحتوي على مجموعات عطرية): تتبع موقع الترابط من خلال طيف الفلورية.
ملاحظات
1. تجربة التحكم: يجب تعيين هيالورونات الصوديوم غير المترابطة والأحماض الأمينية الحرة كعناصر تحكم.
2. تحسين الظروف: قد تؤثر ظروف رد فعل الترابط (الرقم الهيدروجيني، درجة الحرارة، الوقت) على البنية ويجب الإشارة إليها في التقرير.
3. ربط البيانات: دمج نتائج مختلف الأساليب والتحقق من صحة هيكلية الربط المتقاطعة.
من خلال التحليل متعدد الأبعاد أعلاه، يمكن التأكد بشكل كامل من الهيكل الكيميائي، وموقع الترابط العابر، وخصائص المواد لهيالورونات الصوديوم المرتبطة بالأحماض الأمينية.
