لو فان، أولي يونغ، ماركوس هيرمان، مارينا شيروكيك، سانيا ستويانوفيتش، ستيفو ناجمان، فابيان كورتي، شين شيونغ، كاتيا شينكي-لايلاند*، ومايك باربيك*

برز الربط المتقاطع باستخدام أشعة UVA فوق البنفسجية A والريبوفلافين (UVA/R) كتقنية محورية في العلاجات السريرية، خاصة في طب العيون منذ التسعينيات. على الرغم من اعتماده السريري، فإن غياب وضوح الآلية التفصيلية وضرورة عملية تصنيع متقنة يتطلب المزيد من البحث. تعزز هذه الدراسة فهم الكولاجين المترابط بين UVA/R، مع التركيز على تحديد مواقع الربط المتقاطع الأساسية باستخدام سبعة ببتيدات صناعية واستكشاف مسارات الربط المتقاطع الوسيط بالريبوفلافين.

تظهر النتائج أن بقايا التيروزين هي مواقع رئيسية للربط المتبادل، ويلعب الريبوفلافين دورا مزدوجا كمحفز ومثبط تنافسي في عملية الترابط المتبادل. علاوة على ذلك، تظهر مصفوفة الكولاجين المتشابكة UVA/R توازنا أكثر انسجاما بين الاستقرار والقابلية للتحلل مقارنة بمصفوفات الكولاجين المتداخلة كيميائيا، إلى جانب خصائص ميكانيكية متفوقة وتوافق حيوي معزز. تجارب داخل الجسم الحي.

1. مقدمة

تم استخدام الكولاجينات على نطاق واسع في مجالات مختلفة من الطب الحيوي كمواد حيوية وظيفية، بما في ذلك شفاء الجروح، وترقيع العظام، والتجدد، وطب العيون، وهندسة القلب والأوعية الدموية، وهندسة الأنسجة العصبية.     لتحسين وظيفية الكولاجينات، وخاصة الكولاجين من النوع الأول (الكولاجين)، في هذه التطبيقات، غالبا ما يكون الربط المتقاطع ضروريا، مما يعزز خصائصه الميكانيكية، واستقراره البيولوجي، والتوافق الحيوي، ووظائفه الأخرى. من بين تقنيات الربط المتقاطع المختلفة، تبرز الأشعة فوق البنفسجية A والربط المتقاطع بالريبوفلافين (UVA/R) كتقنية واعدة بشكل خاص، وقد تمت الموافقة عليها للاستخدام السريري في علاج العيون منذ أوائل التسعينيات.   تحمل هذه الراحة والسلامة الكامنة إمكانات هائلة لتوسيع مساحة تطبيقات الكولاجين عبر مجالات الطب الحيوي المتنوعة.

يتقدم مجال الربط الضوئي في UVA بسرعة، كاشفا عن تطبيقات واعدة عبر التخصصات الطبية. تمتد فائدته الآن إلى إنتاج هيدروجيلامات مبتكرة تهدف إلى تقليل الالتصاقات بعد العملية، والتي لديها القدرة على إعادة إبعاد التعافي من جراحة المنظار. علاوة على ذلك، يتم تقييم قرنية الخنزير غير الخلوية المتشابكة UVA/R كأساس محتمل لأطروحة كيراتوبروس في بوسطن، مما يعكس تقدما كبيرا في التوافق الحيوي والكفاءة. تنوع تطبيق هذه التقنية، حيث تم تطوير طرق رائدة مثل التحضير الخالي من الغلوتارالديهايد لزراعة القلب، وهندسة أنسجة الغضروف الهلالي، وأجهزة توصيل الأدوية المسيطر عليها، وتوسع تأثيرها إلى مجالات بحثية متقدمة مثل الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد وأنظمة الأعضاء على شريحة، مما يبرز الإمكانات الديناميكية للربط الديناميكي بين UVA/R في الهندسة الطبية الحيوية الحديثة.

على الرغم من هذه التطبيقات الواعدة، لا تزال آلية إلغاء الربط المتقاطع بين UVA/R مجالا لإعادة بحث ونقاش مستمر. تشير العديد من الدراسات إلى أن الريبوفلافين يعمل بشكل أساسي كمحفز ضوئي يولد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) لتحفيز أكسدة الكولاجين والبلمرة. تقترح نظريات بديلة أن هذه عملية كيميائية ضوئية أكثر تعقيدا، وهي تعتمد على التعرض للحمض النووي فوق البنفسجي (UVA). توجد أيضا نقاشات حول مواقع الربط العرضي البسيط على جزيئات الكولاجين، حيث يؤكد البعض عدم الانتقائية، بينما يشير آخرون إلى الأحماض الأمينية مثل الجيب، الهيستيدين، الأرجينين، التيروزين، أو الميثيونين.   

 تؤكد هذه الآراء المتنوعة حول آليات الربط المتقاطع في UVA/R على نقص الفهم الشامل، مما يشكل تحديات في توحيد عمليات التصنيع والتقييم التنظيمي للأجهزة الطبية. لمعالجة هذه الفجوات في المعرفة وزيادة التطبيقات باستخدام الكولاجين، تبحث دراستنا في المبادئ الأساسية لربط UVA/R.

من خلال استكشاف التفسيرات الميكانيكية البديلة وكشف التفاعلات المعقدة بين الكولاجين وري-بوفلافين، نقدم رؤى قيمة تساهم في تحسين وتحسين تقنيات الربط المتقاطع UVA/R.   ومع ذلك، فإن دراسة آلية الربط المتقاطع في الكولاجين تمثل تحديات كبيرة بسبب العمليات الكيميائية الضوئية الديناميكية والتعقيد الجزيئي للكولاجين. لكشف هذه الآليات التفصيلية، يتطلب الأمر تقنيات تجريبية متقدمة وطرق تحليلية شاملة لتحديد وتوصيف الوسيط العابر والمسارات بدقة. بالإضافة إلى ذلك، فإن التفاوت في الخصائص الفيزيائية والكيميائية للكولاجين، المتأثر بمصدر الكولاجين ونوعه ومعالجته وعوامل البيئة، يضيف طبقات من الصعوبة لهذه الدراسات، مما يستلزم اتباع نهج دقيق لفهم عملية الربط المتقاطع بشكل كامل.

في دراستنا، اعتمدنا إطارا تجريبيا مبتكرا، حيث قمنا بتصنيع سبعة ببتيدات صناعية تمثل مواقع الربط المتقاطع الكامنة على الكولاجين، مع التركيز على بقايا الأحماض الأمينية مثل التيروزين (Y)، والليسين (K)، والأرجينين (R)، والميك-ثيونين (M)، والهيستيدين (H)، والتريبتوفان (W)، والفينيل ألانين (F). تم اختيار هذه الأحماض الأمينية لمجموعاتها التفاعلية ومواقعها في المنطقة غير الحلزونية لجزيء الكولاجين، والتي تعد أكثر سهولة لتفاعلات الربط المتقاطع وضرورية لتعزيز الخصائص الميكانيكية.  (الشكل 1) من خلال تعريض هذه الببتيدات والكولاجين الأصلي لنسب طاقة UVA ونسب ري-بوفلافين متغيرة، قمنا بتشريح عملية الربط المتقاطع باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة-مطيافية الكتلة (LC-MS). كما قارنا الربط المتقاطع بين UVA/R والروابط الكيميائية، باستخدام مطيافية رامان المجهرية لاكتشاف التغيرات الجزيئية المميزة بعد التشابك. قمنا بتقييم القوة الميكانيكية، والاستقرار الحراري، ومقاومة التحلل، والسمية الخلاية، وتوج ذلك بتجارب زرع في الجسم الحي لتقييم التوافق الحيوي وإمكانية إعادة تكوين الأنسجة.

من خلال تشريح عملية الربط المتقاطع على المستوى الجزيئي، تكشف دراستنا عن رؤى حاسمة حول أدوار وتفاعلات الأحماض الأمينية المحددة، مما يسلط الضوء على الديناميكيات المعقدة للربط المتقاطع في UVA/R. تحمل هذه الاكتشافات تداعيات كبيرة لتقدم علم المواد الحيوية، مما يؤسس أساسا لتطوير مواد حيوية متقدمة ومتوافقة حيويا وقوية ميكانيكيا، مما يمهد الطريق لتطبيقات طبية حيوية أكثر فعالية وأمانا.

الشكل 1.  مخطط لربط كولاجين UVA/الريبوفلافين. UVA: الأشعة فوق البنفسجية ضوء A، مصدر التنشيط الضوئي. R: ريبوفلافين على حالة الأرض. R*: حالة مثارة للريبوفلافين عند التعرض الأولي للأشعة فوق البنفسجية. 3 R*: حالة ثلاثية ري-بوفلافين بعد العبور بين الأنظمة، وهي حالة طاقة أعلى قادرة على الانخراط في تفاعلات الربط المتقاطع. O2: الأكسجين الجزيئي. 1 O2: الأكسجين المفرد، وهو نوع من الأكسجين التفاعلي يولد من نقل الطاقة من الريبوفلافين المنشط ضوئيا إلى الأكسجين الجزيئي. HO2 •: راديكال هيدروبيروكسيل. RH: الهيكل العام الذي يمثل مانحا للهيدروجين.  Rox: الشكل المؤكسد للمانح بهيدروجين بعد نقل الهيدروجين. الأحماض الأمينية: Y (تيروزين)، K (ليسين)، R (أرجينين)، M (ميثيونين)، H (هيستيدين)، W (تريبتوفان، غير موجود في كولاجين الخنازير النوع I)، F (فينيل ألانين).

2. النتائج والنقاش

2.1. تحضير وتوصيف مصفوفة الكولاجين

الكولاجين من النوع الأول، المستخرج من جلد الخنزير بسبب تشابه نسيج الإنسان، يشكل إطارا قويا لهندسة الأنسجة. يعد هذا النوع من الكولاجين مثاليا للتطبيقات الطبية الحيوية بسبب وفره في الجلد وبنيته الحلزونية الثلاثية المحددة جيدا التي تتكون من سلسلتين α1 وسلسلة α2 واحدة (الشكل2A). أشارت SDS-PAGE إلى سلامة ونقاء الكولاجين المستخرج من خنازير الخنزير بعد سلسلة من عمليات التجانس الميكانيكية، باستخدام كولاجين ذيل الجرذ كوسيلة تحكم.

يعرض الشكل 2B أشرطة مميزة في جل SDS-PAGE لكل من الكولاجين المشتق من جلد الخنزير (P-col) والكولاجين المشتق من ذيل الجرذ (R-col)، مع إبراز نطاقي α 1 وα2 عند ≈150 و140 كيلو دالتون على التوالي. لم تلاحظ أي نطاقات أخرى أقل من 100 كيلو دالتون. كما كانت نطاقات الوزن الجزيئي الأعلى، التي تتوافق مع الديمرات (β) والتريمرز (y)، ملحوظة، مما يشير إلى نقاء مصفوفة الكولاجين العالية والحفاظ على سلامتها بعد المعالجة الميكانيكية. قدمت مطيافية ثنائية اللون الدائري (CD) تأكيدا إضافيا، حيث أظهرت قمم سالبة وموجبة مميزة تشير إلى وجود تكوين ثلاثي حلزوني محفوظ جيدا للكولاجين (الشكل2C). يعد هذا النقاء العالي والسلامة الهيكلية أمرا حيويا للتداخل الفعال مع عوامل الربط المتقاطع وتحليل الخصائص الميكانيكية الدقيقة.

تم استخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لتقييم التغيرات الشكلية في مصفوفات الكولاجين قبل وبعد الربط المتقاطع بين UVA/R.  (الشكل 2D) في البداية، أظهر الكولاجين غير المتشابك انحناء سطحي فريد يشبه البلورة في حالته المائية-المجمدة، مبتعدا عن البنية الليفية التوافقية بسبب عمليات التجانس والتحريك والرغوة التي تم تنفيذها أثناء تحضيره (الشكل 2Da). كان هذا التعطيل المتعمد ضروريا لتصميم المصفوفات الأبعد. بعد الربط المتبادل، لوحظ تكوين تحول ملحوظ في مصفوفة الكولاجين المتشابعة UVA/R. أظهر هيكلا معقدا ومساميا مع فراغات ومسام مترابطة، يتراوح حجمها بين 1 و20 ميكرومتر، مما ساهم في تعقيده ثلاثي الأبعاد. (الشكل 2Db) قد يعزز التباين في حجم المسام بيئة أكثر طبيعية وديناميكية للخلايا، مما يسمح بتنوع التصاق الخلوي، والهجرة، ونقل العناصر الغذائية، وهي ضرورية لإعادة تكوين وإصلاح الأنسجة. علاوة على ذلك، قد تعزز ألياف الكولاجين المعاد هيكلتها الإشارات الميكانيكية التي يمكن أن توجه محاذاة الخلايا وتدريجيا، مما يساهم في تكوين بنية أنسجة أكثر وظيفية وتنظيما في التطبيقات الطبية الحيوية.

علاوة على ذلك، يشير الكثافة وزيادة الكثافة الناتجة عن التفتيش إلى مقاومة متزايدة للتشوه الميكانيكي، وهي سمة أساسية للمواد الحيوية المعرضة للإجهادات الفسيولوجية (الشكل 2Dc,d). هذا التعزيز الميكانيكي لا يضمن فقط السلامة الهيكلية لمصفوفة الكولاجين تحت ظروف فيزيائية مختلفة، بل قد يطيل أيضا عمرها الوظيفي، مما يجعلها أكثر ملاءمة للتطبيقات الطبية الحيوية طويلة الأمد مثل الأجهزة القابلة للزرع أو النماذج القديمة للأنسجة.

الشكل 2.  التوصيف الهيكلي والميكانيكي للكولاجين قبل وبعد معالجة UVA/الريبوفلافين. أ) النموذج الجزيئي لبنية اللولب الثلاثي من النوع الأول للكولاج، وهو اللبنة الأساسية لمصفوفات الكولاجين. ب) تحليل SDS-PAGE الذي يصور توصيف الكولاجين من النوع الأول المستخرج من ذيل الجرذ (R-col) وجلد الخنزير (P-col). ج) أطياف ثنائية اللون الدائري (CD) ل-R-col و P-col، مع إهليلجية تشير إلى الحفاظ على البنية الثانوية لجين الكولا. د) صور المجهر الإلكتروني الماسح التي تعرض الفحص الشكلية للكولاجين غير المتقاطع، والكولاجين المترابط UVA/R في حالته المائية المجمدة (a,b)، وكذلك في حالته الليفلية (c,d).

2.2. استكشاف آلية الربط المتقاطع UVA/R

بعد أن أوضحنا الجوانب الأساسية لتحضير مصفوفة الكولاجين وحللنا خصائصها الأولية، تعمقنا في استكشاف آلية الربط المتقاطع بين UVA/R، وهي عملية محورية تغير وتعود خصائص المصفوفة بشكل كبير. يبحث هذا القسم في أماكن تكوين الروابط المتقاطعة على جزيء الكولاجين، ودور الريبوفلافين كمحفز أو مشارك، ويطرح ضرورة تعديل الربط المتقاطع للكولاجين UVA/R في التطبيقات المتنوعة.

2.2.1. أين تتكون الروابط المتقاطعة على جزيء الكولاجين؟

في دراستنا، بحثنا في آلية الربط المتقاطع للكولاجين من النوع الأول على المستوى الجزيئي، مع التركيز على المناطق غير الحلزونية التي تعزز الخصائص الميكانيكية بعد التشابك. باستخدام سبعة ببتيدات صناعية تمثل الأحماض الأمينية الحيوية — التيروزين (Y)، الليسين (K)، الأرجينين (R)، الميثيونين (M)، الهيستيدين (H)، التريبتوفان (W)، والفينيل ألانين (F)—هدفنا تحديد مواقع محددة للربط المتقاطع. تم تحليل هذه الأحماض الأمينية لوظائفها التفاعلية المميزة ووضعياتها الاستراتيجية داخل الكولاجين الجزيء (الشكل S1، دعم التكوين). تحديدا، يمتلك التيروزين (Y) مجموعة فينول تفاعلية قادرة على الانخراط في الترابط التساهمي. الليسين (K) والأرجينين (R) مجهزان بمجموعات أمينية تعتبر كمرشحة لتكوين الروابط الكيميائية.

الهيستيدين (H) يتم تفعيله بواسطة حلقة إيميدازول، والفينيل ألانين (F) بواسطة حلقة أروماتيكية، وكلاهما مواقع محتملة للتفاعل. حددت تحليلات LC-MS نمطا مميزا: حدثت التعديلات بعد علاج UVA/R حصريا في المد والجزر الحاملة للتيروزين، ويرجح أن ذلك بسبب توليد أعمار الروابط التساهمية ثنائية التيروزين (الشكل 3A,B). وقد عززت هذه الخصوصية غياب نواتج الروابط التساهمية في الأحماض الأمينية الستة الأخرى بما في ذلك الببتيدات، مما يبرز الدور التفضيلي للتاي-روزين في آلية الربط المتقاطع (الشكلان S2 و S3، معلومات الدعم). تم تأكيد الميل لتكوين دي-تيروزين، الذي افترضنا في البداية من دراساتنا للببتيدات الصناعية، بشكل قاطع من خلال تحليل LC-MS لتحليل الهدروليزات في الكولاجين المترابط UVA/R (الشكل 3C,D).

خلال فحص أمة الكولاجين المترابط UVA/R، تم تحديد دي-تيروزين بشكل موثوق باستخدام وضع مراقبة التفاعل المتعدد (MRM) في مطيافية الكتلة وتم التحقق منه من خلال المقارنات مع معيار دي-تيروزين. ومن الجدير بالذكر أن تدقيقنا في LC-MS لتحليل الكولاجين للهيدروسيزاتات كشف عن ذروة تشبه إلى حد كبير، لكنها قابلة للتمييز، مع معيار دي-تيروزين. مع الاعتراف باحتمال وجود تغيرات متساوية أو مكانية داخل جزيئات الكولاجين، نستنتج بحذر، بناء على الاعتبارات الكتلية، أن القمم المتزامنة قد تمثل أشكال دي-تيروزين (الشكل S4، معلومات داعمة). نظرا لكمية البروتين للكولاجين من النوع الأول من الخنازير (أرقام الوصول A0A1S7J210 ل COL1A1 و A0A1S7J1Y9 ل COL1A2)، يجب أن يظهر جزيء الكولاجين الناضج الكامل وزنا جزيئيا يبلغ 282.85 كيلو دالتون، يشمل 3152 بقايا حمض أميني، بما في ذلك 13 بقايا تيروزين.

إذا افترضنا أن جميع هذه البقايا التيروزينية تفاعلية بنفس القدر ومتاحة للربط المتقاطع، فإن تحليل LC-MS يشير إلى أن تقديرا محافظا للتيروزين المتشابك داخل مصفوفة الكولاجين لا يقل عن 14.3٪ (الشكل S5، معلومات داعمة). يعد هذا الاستنتاج أداة لتقييم مدى الربط المتقاطع للكولاجين الناتج عن ظروف UVA/R ويثري فهمنا لآلياته.

يعد إثبات وجود دي-تيروزين في الكولاجين المترابط المتقاطع من UVA/R المحلل هو تأكيد محوري على حصرية التيروزين في مخطط الربط المتقاطع. هذه الأدلة لا تعكس فقط نتائج تجارب الببتيدات الصناعية، بل تجسد أيضا الأهمية العملية لربط التيروزين في الكولاجين الأم. يعد وجود دي-تيروزين علامة جزيئية لنجاح الربط المتبادل، حيث يقدم رؤية ضرورية من المتوقع أن تكون حاسمة لتحسين تقنيات الربط المتقاطع UVA/R في الكولاجين المصممة للاستخدامات الطبية الحيوية.

2.2.2. ريبوفلافين: محفز الربط المتقاطع أم المشارك؟

عند استكشاف دور الريبوفلافين في الترابط المتقاطع للكولاجين، تكشف دراستنا عن وظيفته المزدوجة كمحفز وشريك في آن واحد.  من خلال دراسة العلاقة بين نسب التيروسين والريبوفلافين في كل من نظامي الببتيد والكولاجين، لاحظنا اتجاهات ملحوظة مماثلة: ارتباط إيجابي بين الربط المتقاطع بين الريبوفلافين عند النسب الأقل، والذي ينعكس عند تركيزات أعلى (الشكل 3E). على سبيل المثال، في الكولاجين، عند تركيزات ريبوفلافين منخفضة (نسب التيروزين/ريبوفلافين من 1/0.0625 إلى 1/0.25)، كان هناك زيادة كبيرة في معامل التخزين والعمر مقارنة بالكولاجين غير المتقاطع. ومع ذلك، عند تركيزات أعلى، ينخفض معامل التخزين بشكل حاد (الشكل 3F).

أدى الانخفاض الملحوظ في القوة الميكانيكية لمصفوفات الكوللاجين عند تركيزات مرتفعة من الريبوفلافين إلى استكشاف الآليات الأساسية.  استشهد بحثنا بنموذج حركي نظري، يشير إلى الاعتماد النقدي على المسارين للربط الفو عبر الريبوفلافين على مستويات الأكسجين المحيطة. ألهم هذا النموذج اكتشافنا: كفاءة الربط المتقاطع حساسة بشكل ملحوظ لتركيز الريبوفلافين، خاصة في البيئات التي تتوفر فيها الأكسجين بشكل مستمر.

هذا السلوك الكيميائي الضوئي الدقيق للريبوفلافين يشير إلى مسارين رئيسيين للتفاعل عند إثارة UVA، كما هو موضح في الشكل 1. في البداية، يعمل الريبوفلافين كمحفز ضوئي، مولدا ROS يسهل الترابط بين الجزيئات، خاصة في بقايا التيروزين الموجودة في المناطق غير الحلزونية للكولاجين. تعزز هذه العملية الخصائص الميكانيكية للمصفوفة. ومع ذلك، يصبح مسار بديل سائدا عند تركيزات أعلى من الريبوفلافين، حيث يشارك الريبوفلافين بنشاط في تفاعل التشابك، مما يقلل من ROS وبالتالي يقلل من كفاءة الربط المتبادل. علاوة على ذلك، قد تؤدي عمليات نقل الإلكترونات إلى تداخل بين بقايا الأحماض الأمينية موجبة الشحنة مثل الليسين، الهيستيدين، والأرجينين، والريبوفلافين سالب الشحنة، مما قد يؤثر على الخصائص الميكانيكية لمصفوفة الكولاجين. هذا الجانب يستحق المزيد من التحقق التجريبي.

بالإضافة إلى ذلك، تم تحسين التعرض لأشعة UV لربط الكولاجين ما-تريكس في دراستنا. تشير نتائجنا كما هو موضح في الشكل 3E إلى أن التعرض الأمثل للأشعة فوق البنفسجية لربط مصفوفات كولا-جين كان 10800 مللي جول cm_2. بعيدا عن جرعة UVA هذه، انخفض معامل تخزين مصفوفات الكولاجين بشكل ملحوظ، مما يشير إلى احتمال تدهور طية سقل الكولاجين بسبب التعرض الزائد. ومن المثير للاهتمام أنه بالنسبة لربط الببتيدات المتبادل، كانت الجرعة المثلى من UVA أقل بكثير، عند 600 مللي جول cm_2 (الشكل S6، معلومات داعمة)؛ وفي عمل آخر، حدد يو-مورا وآخرون أن التعرض الأمثل لأشعة UVA لربط كولاجين العاج البشري كان 1600 مللي جول cm_2.

بشكل عام، تكشف هذه الرؤى عن طبقة إضافية من آلية الربط المتقاطع UVA/R، مما يبرز الحاجة الملحة لضبط تركيز الريبوفلافين والتعرض للأشعة فوق البنفسجية للتطبيقات العملية. التفاوت الملحوظ بين بيئة الأنسجة في الجسم الحي وأنظمة الربط المتقاطع للكولاجين في المختبر كبير جدا. تتطلب التغيرات في مصادر الكولاجين (محتوى بقايا التيروزين)، والتركيز، والكثافة، وظروف العزل المختلفة طرقا مخصصة لضبط تركيز الريبوفلافين والتعرض للأشعة فوق البنفسجية لتحقيق أفضل نتائج الربط المتقاطع.

الشكل 3.  تشريح آلية الربط المتقاطع UVA/R في الكولاجين. أ) كروماتوغرافيات LC-MS بعد معالجة UVA/R لببتيد Ac-AGGY-NH2 باستخدام عينات ضابطة من Ac-AGGY-NH2 والريبوفلافين.  ب) أطياف الكتلة المرتبطة بالقمم الجديدة (a–d) في الكروماتوغرامات لمعالج AC-AGGY-NH2 المعالج بالUVA/R. ج) كروماتوغرامات LC-MS لمعيار داي-تيروزين وتحليل الكلاجين غير المتشابك والكولاجين UVA/R المتشابك D) مع أطياف كتلة مقابلة. ه) معامل التخزين (G') للكولاجين كدالة للتعرض للأشعة فوق البنفسجية (mJ cm_2)، مما يبرز الزيادة المعتمدة على الجرعة في الخصائص الميكانيكية. و) معامل التخزين (G') بالنسبة لنسبة Tyr (في الكولاجين)/الريبوفلافين، مما يوضح تأثير اختلاف تركيزات الريبوفلافين على القوة الميكانيكية لمصفوفات الكولاجين.

2.3. التحقيق المقارن في تأثير UVA/R والربط الكيميائي على مصفوفات الكولاجين

بعد توضيح تعقيد آلية الربط المتقاطع UVA/R، وجهنا اهتمامنا إلى التحقيق المقارن الذي يهدف إلى تقييم شامل لتأثيرات تقنيات الربط الكيميائي المختلفة على مصفوفات الكولاجين. يساهم كل تحليل في فهم شامل للتغيرات الهيكلية والوظيفية التي تسببها UVA/R وطرق الربط الكيميائي الأخرى.

2.3. 1. مطيافية رامان المجهرية

قدم تحليل رامان الميكروسكوبي رؤية عميقة حول السلامة الجزيئية لمصفوفات الكولاجين التي تخضع لتقنيات الربط المتقاطع المختلفة. يتم تجميع التعيينات التفصيلية للذروة مع مراجعها المقابلة في الجدول S3 (معلومات داعمة). في دراستنا، احتفظ كولاجين Col UVA/R (Xcol_UVA/R) وكولاجين EDC/NHS (Xcol_EDC/NHS) بتركيباتهما الثانوية النموذجية بعد الربط المتقاطع مقارنة بالكولاجين غير المتشابك (Col)، كما يتضح من متسق نطاقات الأميد عبر جميع العينات: Amide III (1260 cm_1)، Amide II (1452 cm_1)، وأميد I (1664 cm_1) (الشكل4A).

كشفت الأطياف أنه بينما كان الهيكل الثلاثي الحلزوني المميز للكولاجين محفوظا، كانت هناك انخفاضات ملحوظة في شدة القمم (815، 936، 971، و1080 cm_1) المرتبطة بتغيرات السلسلة الجانبية للأحماض الأمينية المشاركة في تفاعلات الربط المتقاطع UVA/R وEDC/NHS. تشير هذه النتائج إلى إعادة ترتيب جزيئية دقيقة لكنها حاسمة داخل هيكل الكولاجين، خصوصا أوضاع الاهتزاز مثل تمدد C-C، وتمدد C-C، وتمايل CH3 داخل بقايا الليسين، الهيدروكسيلسين، والتيروزين، وهي ضرورية لعملية الربط المتقاطع.

ومن الجدير بالذكر أن مدى تقليل الشدة كان أكثر وضوحا في الكولا-جين المتقاطع بين EDC/NHS، مما يشير إلى وفرة أعلى من الروابط المتقاطعة التي تعبر فيها الليسين والهيدروكسي ليسين مقارنة بالروابط التي تتتوسط بواسطة التيروزين في الربط المتقاطع UVA/R. قد يشير التحول المثير للاهتمام من 936 إلى 927 cm_1 بعد الربط بين EDC/NHS قد يشير إلى زيادة العشرة الناتجة عن تعبئة بقايا البرولين بعد الربط المتقاطع.

أكد المزيد من التدقيق عبر تحليل المكونات الرئيسية متعددة المتغيرات (PCA) هذه الفروق الهيكلية، مميزا بين العينات غير المعالجة والمترابطة (الشكل 4B–D). وقد أوضح التجميع المميز لدرجات PC-3 وPC-4 الأسس الجزيئية الفريدة لكل علاج، حيث أظهر الربط المتقاطع بين UVA/R بصمة جزيئية مميزة مقارنة بنظيره الكيميائي. كانت درجات PC-3 إيجابية واضحة في طيف Xcol_UVA/R والدرجات السلبية ل Col و Xcol_EDC/NHS. وقد تم تكرار هذا الاتجاه في مخطط تحميل PC-3، حيث تميز بدرجات قمم بارزة عند 936 cm_1 (برولين) و1688 cm_1 (أميد I).

وبالمقابل، كشفت درجات PC-4 عن نطاقات إيجابية لكل من Xcol_UVA/R و Xcol_EDC/NHS، بينما تجمعت أطياف كولونيا في النطاق السلبي. حدد مخطط الأحمال المقابل في PC-4 القمم المرتبطة بالربط المتقاطع عند 896، 980، 1099، 1309، 1439، و1655 cm_1، مما يشير إلى أنماط الاهتزاز 0 (C-C)، 0 (C-N)، بالإضافة إلى تشوه أنماط التواء أو الانحناء أو التحرك CH3 / CH2 وغيرها، مما يعزز التمييزات الجزيئية المدفوعة بالربط المتقاطع التي لوحظت.

قدم مطيافية رامان المجهرية أنماط بصمة جزيئية توضح التغيرات التي تحدث على المستوى الجزيئي في الكولاجين بعد التشابك، بالإضافة إلى اختلاف الخصائص بين الكولاجين المترابط بواسطة طرق UVA/R وEDC/NHS. تعد هذه النتائج الطيفية محورية في توجيه عملية تحويل الكولاجين إلى تطبيقات طبية حيوية متقدمة.

2.3.2. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لمصفوفة الكولاجين المهضمة

كشفت كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) للعينات المهضومة بالكولاجنازات عن اختلافات واضحة في الملف الجزيئي لمصفوفات الكولاجين بعد الربط المتقاطع (الشكل 4E–G). نظرا لأن الكولاجيناز يقطع بشكل أساسي الروابط الببتيدية داخل جزيئات الكولاجين عند الثلاثيات المميزة Gly-X-Y، حيث غالبا ما يكون X و Y بقايا برولين أو هيدروكسي برولين، فإن عملية الهضم الإنزيمية تنتج شظايا ببتيدية أصغر. وجود شظايا ببتيدية أكبر في العينات المتشابكة، والذي يظهر بشكل خاص في منطقة القمة 1، يدل على فعالية الربط المتقاطع في عرقلة الانقسام الإنزيمي. كان هذا الاكتشاف واضحا بشكل خاص في الرابط المتقاطع، حيث تم الاحتفاظ بالكيانات الببتيدية الكبيرة إلى حد ما.

الشكل 4.  توصيف شامل للكولاجين غير المتقاطع، والكولاجين المتداخل UVA/R (Xcol_UVA/R)، والكولاجين المترابط EDC/NHS (Xcol_EDC/NHS)، والكولاجين المترابط الجيني (Xcol_Genipin). أ–د) تحليل رامان الميكروسكوبي: (أ) أطياف رامان المتوسطة التي تبرز القمم والأنماط المختلفة. تم تكرار كل حالة ثلاث مرات على الأقل (n ≥ 3)، مع الحصول على عدة طيف لكل نسخة (n ≥ 25). تشمل نتائج تحليل البيانات متعددة المتغيرات نتائج تحليل المكونات الرئيسية (PCA) التي تتضمن الأحمال الطيفية ل PC-3 وPC-4 (C)، ورسم الدرجات بين PC-4 مقابل PC-3 (B)، والتمثيل الإحصائي لدرجات PC-3 وPC-4 كقيم متوسطة ± SD (D). الحذف الناقص في (B) يشير إلى فترات ثقة بنسبة 95٪. E–G) تحليل الكروماتوغرافيا بحجم-استبعاد الحجم: آثار تمثل سلوك مصفوفات الكولاجين، كما يتم اكتشافها باستخدام كاشف الأشعة فوق البنفسجية. تظهر المشاهد المقربة للقمة 1 والقمة 2 بالتفصيل في (F) و (G). معامل التخزين الديناميكي H (G') ومعامل الخسارة (G'') المستخرج من منطقة الهضبة LVE أثناء عمليات المسح الترددي.

مشابه لتلك الخاصة بالعينات المترابطة كيميائيا. تسلط هذه الملاحظة الضوء على الفعالية المماثلة لربط UVA/R مع الطرق الكيميائية التقليدية مثل EDC/NHS والجينيبين في حماية مصفوفات الكولاجين من الهضم الإنزيمي. علاوة على ذلك، أظهر الربط المتقاطع UVA/R موقفا جيولوجيا أدفانتا مع عدد أقل من المنتجات الثانوية الأصغر مقارنة بالربط الكيميائي المتبادل.

أظهرت الكروماتوغرامات لعينات EDC/NHS والمعالجة بالجينيبين ذروتا إضافية، مما يشير إلى وجود نواتج ثانوية قد تؤدي إلى إكيتات سامة للخلايا أو تحفيز استجابات مناعية عند استخدامها في التطبيقات الطبية الحيوية. على النقيض من ذلك، يبدو أن عملية الربط المتقاطع UVA/R أدت إلى ملف أنظف مع تجزئة أقل، مما قد يترجم إلى ملف أمان أكثر ملاءمة للتطبيقات في الحي. النزاهة الجزيئية الرئيسية التي يحافظ عليها الربط المتقاطع بين UVA/R، إلى جانب ملف المنتج الثانوي المنخفض، تضعه كطريقة فعالة لتحضير المواد الحيوية القائمة على الكولاجين للطب التجديدي.

2.3.3. الخصائص الريولولوجية

قدمت الخصائص الرئولوجية لمصفوفات الكولاجين المتقاطعة، كما حللت بواسطة عمليات توسيع وإجهاد القص الديناميكي وعمليات التردد، رؤى حول الآثار الميكانيكية لكل استراتيجية ربط متقاطع عند درجات الحرارة الفسيولوجية. (الشكل أظهر 4H,I) Xcol_UVA/R مظهرا مرنا محسنا كما يتضح من معامل التخزين، دون فقدان متوافق في مرونة المادة. يبرز هذا التوازن بين المرونة والمتانة إمكانات الربط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية/المقاومة لتعزيز السلامة الميكانيكية لسقالات الكولاجين دون التضحية بقدرة المادة على امتصاص وتبدد الطاقة، وهي سمة أساسية للمواد الحيوية التي يجب أن تتحمل بيئات فسيولوجية ديناميكية.

من ناحية أخرى، قدمت Xcol_EDC/NHS حالة تخزين أقل بشكل غير متوقع (الشكل 4I)، مما يشير إلى أنه رغم أن الربط الكيميائي مع EDC/NHS يغير المادة، إلا أنه قد لا يدعم بشكل موحد خصائص مرونة لمصفوفة الكولاجين. قد يكون لهذا الاكتشاف آثار على تطبيق المواد المترابطة بين EDC وNHS في السيناريوهات التي يكون فيها التثبيت الميكانيكي شرطا أساسيا. وعلى النقيض من ذلك، أظهر Xcol_Genipin طية واضحة في الخشب، كما يتضح من معامل التخزين الأعلى. ومع ذلك، قد يفرض الصلابة المتزايدة قيودا على التوافق الوظيفي للمادة، خاصة فيما يتعلق بالأنشطة الخلوية. المواد التي تحتوي على أمراض منقولة جنسيا بشكل مفرط قد تعيق بشكل فعال هجرة وتكاثر الخلايا، وكلاهما ضروري لتجديد ودمج الأنسجة.

عند جمع هذه النتائج مجتمعة، تشير إلى أن الربط المتقاطع بين UVA/R يحقق توازنا مثاليا بين الصلابة والمرونة، مما قد يساعد على وظائف الخلايا، مما يشكل طريقا واعدا لتطوير السكاولدات القائمة على الكولاجين في الطب التجديدي.

2.3.4. الاستقرار الحراري

قدمت قياسات القياس الحراري الماسح الديرينتيالي (DSC)، الموضحة في الشكل 5A,B، رؤى أساسية حول الاستقرار الحراري لمصفوفات الكولاجين. يشير تمباطر الإزالة (Tm)، الذي يلاحظ كقمة على منحنيات DSC، إلى نقطة الانتقال حيث يبدأ الحلزون الثلاثي الكولاجين بالانفصال نتيجة انهيار الروابط الهيدروجينية المثبتة. يصاحب هذا الحدث الحراري امتصاص الحرارة، والتي تقاس كميا كتغير في الإنثالبيا (ΔH).

في دراستنا، تم تسجيل ارتفاع ملحوظ في التيموليوم في عينات الكولاجين المتقاطعة. على وجه التحديد، يظهر Xcol_UVA/R و Xcol_EDC/NHS قيم Tm عند 75 و76.0 درجة مئوية على التوالي، مما يشير إلى زيادة الاستقرار الحراري الذي قد يساعد في الحفاظ على السلامة الهيكلية عند درجات الحرارة الفسيولوجية. Xcol_Genipin، رغم عرض حرارة أقل عند 60.1 درجة مئوية، إلا أنه لا يزال يظهر مقاومة حرارية متزايدة مقارنة بالكولاجين غير المتشابك. تدعم التغيرات في الثالبيا (ΔH) المرتبطة بعملية إزالة الطبيعة كما هو موضح في الشكل 5B هذه النتائج، حيث أظهرت التحليلات Xcol_UVA/R و Xcol_EDC/NHS امتصاصا كبيرا للحرارة، مما يعكس الطاقة المطلوبة لتعطيل بنية الكولاجين المعززة بسبب الترابط المتقاطع. تشير هذه الخصائص الديناميكية الحرارية إلى أن الربط المتقاطع يمنح استقرارا إضافيا لمصفوفات الكولاجين، وهو أمر حاسم لأدائها تحت الإجهاد الحراري في الجسم الحي.

2.3.5. مقاومة التحلل

امتدت دراستنا إلى تحليل تحلل مقارن لمصفوفات الكولاجين المتشابكة في ظروف فسيولوجية ذات صلة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وحلويات الكولاجيناز (الشكل 5C,D). كان ملف التحلل في Xcol_UVA/R مقنعا بشكل خاص، حيث أظهر مقاومة تعادل مقاومة المصفوفات المتشابكة كيميائيا، مما يمثل تحسنا كبيرا مقارنة بالكولاجين غير المتقاطع. هذه الملاحظة محورية، لأنها الأولى التي تقارن مباشرة مقاومة الانحلال للكولاجين المتشابك UVA/R مع المتحورات المتشابكة كيميائيا. أظهر Xcol_EDC/NHS متانة استثنائية في PBS، حيث حافظ على أكثر من 60٪ من كتلته بعد 30 يوما، مما يدل على إمكاناته في التطبيقات التي يكون فيها الاستقرار الممتد أمرا بالغ الأهمية. كما أظهر الكولاجين المتشابك بالجينيبين مقاومة ملحوظة في محاليل الكولاجيناز، مما يشير إلى ملاءمته للبيئات التي تشهد تحللا نشطا إنزيميا.

ومع ذلك، فإن متانة هذه التقنيات المترابطة كيميائيا تثير مخاوف في سياق هندسة الأنسجة، حيث يجب مزامنة حركيات تحلل السقالة مع تجديد الأنسجة. [75] المواد الحيوية التي تتحلل ببطء شديد قد تفسد العملية الحساسة لتكوين الأنسجة الجديدة، مما قد يؤثر على هجرة الخلايا، وتكوين الأوعية الدموية، وعملية إعادة التشكيل الطبيعية. [30] علاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي الوجود المستمر للمواد غير المتحللة إلى استجابة التهابية مستمرة، مما قد يؤثر سلبا على نتائج الشفاء. [31] في هندسة تيس-سو، يجب أن توفر المادة الحيوية المثالية الدعم الميكانيكي الأولي لكنها تدريجيا تتنازل عن مكانها لصالح تيس-سو الجديدة. لذلك، فإن تحسين معدل التحلل لضمان انتقال سلس من السقالة إلى الأنسجة الأصلية أمر بالغ الأهمية. تسلط نتائجنا الضوء على الحاجة إلى نهج دقيق في تصميم السقالات المعتمدة على الكولاجين، بهدف تحقيق توازن دقيق يدعم إصلاح الأنسجة الأولي ويسمح بدمج الأنسجة الطبيعية دون إثارة التهاب مزمن أو ردود فعل سلبية أخرى.

2.3.6. اختبار سمية الخلايا في المختبر

تم تقييم التوافق الحيوي لمصفوفات الكولاجين لدينا من خلال اختبار CCK-8 باستخدام الأرواما الليفية L929، وفقا لقواعد DIN EN ISO 10993–5: 2009 وDIN EN 10993-12: 2021. يفترض المعيار أن المواد الحيوية لا ينبغي أن تقلل من قدرة الخلايا على البقاء بنسبة أقل من 70٪ من الضابط لتعتبر متوافقة حيويا. كما هو موضح في الشكل 5E، أظهرت مصفوفات الكولاجين المتقاطعة، جزئيا Xcol_EDC/NHS، انخفاضا في قدرة الخلايا، مما يشير إلى احتمال وجود سمية خلوية من عوامل الربط المتقاطع المتبقية أو المنتجات الثانوية. وعلى النقيض من ذلك، تجاوز Xcol_UVA/R عتبة التوافق الحيوي مع صلاحية أكثر من 80٪، مما يدل على ملاءمته لتطبيقات هندسة الأنسجة بسبب توازنه الإيجابي بين الاستقرار والتدهور.

الشكل 5.  توصيف مصفوفات الكولاجين والتقييم البيولوجي في المختبر. أ) منحنيات القياس الحراري التفاضلي للمسح (DSC) التي توضح الانتقالات الحرارية لمصفوفات الكولاجين، مع تمييز بدرجات الحرارة القصوى (Tm). ب) تغيرات الإنثالبي (ΔH) أثناء إزالة مصفوفات الكولاجين. فقدان الكتلة أثناء التحلل في المختبر في محلول C) محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ومحلول D) كولاجناز. ه) اختبار سمية الخلايا في المختبر باستخدام الأرومية الليفية L929 عبر اختبار CCK-8، وفقا لمعيار ISO 10993–5. و) صور المجهر الماسح بالليزر الكونفوكالي (CLSM) لتلوين الخلايا L929 التي زرعت على سقالات الكولاجين بعد 1 و4 و7 أيام من البذر. ز) التحليل الكمي لنسبة الخلايا الحية إلى الميتة، المستمدة من صور CLSM، باستخدام برنامج ImageJ لقياس كمية الخلية. ح) قياس الخلايا الحية، مع تسليط الضوء على بقاء الخلايا وتكاثرها خلال فترة الدراسة. تم إجراء التقييم الإحصائي للأجزاء (G) و(H) باستخدام ANOVA لمقارنات متعددة في نقاط زمنية مختلفة، مع إجراء مقارنات محددة بين مجموعة Xcol_UVA/R والمجموعات الأخرى. (أشرطة القياس في صور التلوين الأحياء والميتة تتوافق مع 100 μم. كالسين باللون الأخضر، وPI باللون الأحمر).

أبرز التلوين الأحياء الموتى (الشكل 5F) مع تحليله الكمي اللاحق (الشكل 5G,H) الأداء المتفوق ل Xcol_UVA/R، الذي دعم بقاء الخلايا وتكاثرها. في البداية، في اليوم الأول، كانت نسب الحي إلى الميت لمجموعتي Col و Xcol_UVA/R قابلة للمقارنة، مما يؤكد نتائج اختبار السمية الخلوية الاستخراجي الموضح في الشكل 5E. ومع تقدم الزراعة إلى اليومين الرابع والسابع، أظهرت طية Xcol_UVA/R تفوقها مع زيادة كبيرة في قدرة الخلايا على البقاء والتكاثر، ويرجح أن ذلك يعود إلى خصائصه البيوميكانيكية. بينما لم تظهر سقالة الكولاجين غير المتقاطعة، رغم توافقها الحيوي، السلامة الهيكلية اللازمة لتفاعلات الخلايا مع المواد المثلى، كما يتضح من أدائه في 4 و7 أيام. على النقيض من ذلك، أظهرت مصفوفات الكولاجين المتداخلة مع EDC/NHS والجينيبين انخفاضا في نسب الخلايا الحية طوال مدة الدراسة، مما قد يثير مخاوف بشأن ملفات سمية الخلايا لديها.

تكشف تحليلاتنا الشاملة التي تشمل ملفات الهضم الإنزيمي، والقوة الميكانيكية، والاستقرار الحراري، ومقاومة التحلل، عند المقارنة مع تقييمات سمية الخلايا في المختبر، عن تقييم متعدد الجوانب لمصفوفات الكولاجين المتشابكة للتطبيقات الطبية الحيوية. يبرز Xcol_UVA/R بملفه المتوازن؛ يظهر استقرارا حراريا ومقاومة متدهورة مماثلة للنظائر الكيميائية المتقاطعة، محافظا على السلامة الهيكلية تحت الظروف الفسيولوجية مع دعم بقاء الخلايا القوية والتفاعلات المواتية بين الخلايا والمادة.

تتوافق نتائج الهضم الإنزيمي، التي تشير إلى انخفاض التحلل في العينات المتشابكة، مع التحسن الملحوظ في الخصائص الميكانيكية والحرارية، مما يؤكد فعالية الربط المتقاطع في تعزيز مرونة الما-تريكس. ومع ذلك، فإن المتانة الميكانيكية وانخفاض التحلل، كما هو موضح في inXcol_EDC/NHS و Xcol_Genipin، قد يشكلان عيبا على التوازن الدقيق المطلوب لإعادة تكوين الأنسجة. تظهر هذه المصفوفات تحللا إنزيميا محدودا وزيادة في مقاومة الحرارة، ومع ذلك يمكن أن تعيق هذه المتانة بشكل كبير إعادة تشكيل الأنسجة الطبيعية، كما يتضح من انخفاض صلاحيتها للخلايا.

في مجال هندسة الأنسجة، حيث من المتوقع أن يمهد تدهور طية السقالات الطريق لصناعة أنسجة جديدة، يفضل استخدام مواد مثل Xcol_UVA/R التي تحقق موازنة مثالية بين الاستقرار والقابلية للتحلل. تسهل وظائف الخلايا دون استدعاء استجابة التهابية مطولة، مما يعزز نتائج الشفاء. باختصار، يؤثر اختيار طريقة الربط المتقاطع بشكل عميق على أداء السقالات، حيث برز الربط المتقاطع UVA/R كنهج واعد لإنشاء سقالات متوافقة حيويا ومستقرة وقابلة للتحلل تساعد على تطبيقات هندسة الأنسجة الناجحة.

2.4. التقييم النسيجي للغرسات تحت الجلد

التوافق الحيوي الاستثنائي والتوصيل العظمي لجين الكولا يجعلانه حجر الأساس لتطبيقات زراعة العظام. ومع ذلك، فإن فائدته تاريخيا كانت محدودة بسبب ثبات الميكانيكا الحيوية. من خلال تطبيق عملية الربط المتقاطعة المبتكرة UVA/R، نجحنا في معالجة هذا القيد، مما عزز بشكل كبير الاستقرار الميكانيكي لطيات سقالات الكولاجين الخاصة بنا. يوفر دمج بدائل العظام غير العضوية (BS)، مثل الهيدروكسيا باتيت و β-TCP، الدعم الميكانيكي اللازم لإعادة تشكيل العظام على المدى الطويل، مع غياب مكونات ECM الحيوية للتفاعلات الخلوية المبكرة وقابلية التحلل في الهياكل.

لذلك، فإن سقالتنا المركبة المبتكرة القابلة للحقن مع مصفوفة الكولاجين المتشابكة UVA/R وBS، مصممة لتحسين تفاعل الخلايا الأولي وإعادة تشكيل العظام المستمرة. من خلال التقييمات تحت الجلد والتقييمات النسيجية غير الدقيقة للسقالات المزروعة، حققنا فهما دقيقا لسلامة المادة وديناميكيات الاستجابة المتعرجة. يشمل ذلك تحليلا معمقا لتفاعلات الأنسجة، وخاصة الاستجابات المناعية، لتحديد التوافق الحيوي واستخلاص رؤى حاسمة للتطبيقات المستقبلية. هذا النهج المنهجي يؤكد التزامنا باستكشاف التفاعل بين أنظمتنا البيولوجية الهندسية والبناء.

2.4. 1. تحليل تفاعل الأنسجة

صبغة موفات الخماسية هي تقنية نسيجية متعددة الأغراض تحدد بوضوح مكونات مختلفة من الأنسجة الاتصالية، مما يسهل تمييزها في المقاطع النسيجية. في هذه الدراسة، تم تلوين موفات الخماسي للاستخدام لتمييز وتحليل شبه كمي لتوزيع GAG والكولاجين داخل أقسام الأنسجة، كاشفا عن سلوكيات مميزة للسقالات المعتمدة على الكولاجين غير المتشابكة المزروعة (BS-Col و BS- Xcol_UVA/R) داخل بيئة الأنسجة (الشكل 6A–C). بحلول اليوم العاشر بعد الزرع، أظهرت كلتا المجموعتين وجود أمومة كولاجينية داخل أسرة الزرع (الشكل 6B).

ومن الجدير بالذكر أن مجموعة BS-Xcol_UVA/R أظهرت التصاق ملحوظ بسطح بديل العظام على عكس العلاقة الفضفاضة التي لوحظت في مجموعة BS-Col، مما يشير إلى استقرار مصفوفة معزز قد يمنحه عملية الربط المتقاطع UVA/R. أكد التحليل الكمي هذه النتائج أكثر، مشيرا إلى وجود محتوى أعلى من الكولاجين في مواقع زرع BS-Xcol_UVA/R مقارنة ب BS-Col (الشكل 6C)، مما قد يثبت التأثير العميق للربط المتقاطع على سلامة المصفوفة. مع تقدم تكوين الأنسجة، أخذت مستويات GAG (GAG) المتشابهة في البداية منعطفا كبيرا، مما أظهر انخفاضا مع مرور الوقت، مما يشير إلى استجابة نسيجية مستمرة، ونشاط خلوي، وعملية إعادة تشكيل ديناميكية للمصفوفة مع مرور الوقت.

بحلول اليوم 30، أظهرت مجموعة BS-Xcol_UVA/R تكونا ملحوظا في محتوى الكولاجين، مع استمرار المصفوفة حول أسطح بدائل العظام. هذا الحضور المستمر، الذي تم التحقق منه من خلال التحليل الكمي، أبرز التأثيرات المستمرة لربط UVA/R على استقرار المصفوفة. (الشكل6C) نضج الأنسجة داخل السقالات، كما يتضح من زيادة التكوين الوعائي في كلا المجموعتين. ومع ذلك، لوحظ ملف مناعي مميز؛ أظهرت مجموعة BS-Col انتشارا أعلى للبلاعم والخلايا العملاقة متعددة الأنوية، مما يشير إلى استجابة مستمرة لتحلل السقالات.

2.4.2. تقييم الاستجابة المناعية

كشفت استكشافاتنا النسيجة للاستجابات المناعية في مواقع الزرع تحت الجلد عن تفاعلات دقيقة بين دفاعات المضيف والمركبات المزروعة القائمة على مصفوفة الكولاجين. في البداية، في اليوم العاشر، كانت البلعم الإيجابية لالتهاب CD11c بارزة حول الزرعات.

الشكل 6.  تفاعل الأنسجة في الجسم الحي والاستجابة المناعية للمواد المعتمدة على مصفوفة الكولاجين: BS-Col و BS-Xcol_UVA/R. أ) رسم تخطيطي يصور المادة المركبة القابلة للحقن المكونة من مصفوفة الكولاجين وبديل العظام (BS)، مزروعة تحت الجلد في فأر BALB/c.

ب) صور نسيجية تمثيلية لمناطق انغراس BS-Col وBS-Xcol_UVA/R في اليومين العاشر والثلاثين بعد الزرع باستخدام صبغة Movat Pen-tachrome. ج) قياس كمية خماسي موفات من خلال تحليل فك الالتفاف اللوني باستخدام ImageJ. الأصفر الأخضر = الكولاجين، والأخضر الأزرق = الجليكوزامينوجليكان (GAG). يعرض كنسبة مئوية من إجمالي المساحة الملطخة. د) صور تمثيلية للمواد المناعية الكيميائية لأنواع البلاعم الداعمة للالتهاب (CD11c) والمضادة للالتهاب (CD163) في مناطق الزرع في المجموعتين المعنيتين. ه) تحليل التحليل النسيجي (الكمي) لأنواع البلاعم الإيجابية CD11c والمولية CD163 في مناطق الزرع في المجموعات المعنية باستخدام ImageJ. النجوم السوداء = بديل العظام (BS)، النجوم الحمراء = الأوعية الجديدة المكونة، المثلث البرتقالي = الكولاجين، المثلث الأخضر = الخلايا العملاقة متعددة النواة، المثلث الأصفر = خلايا CD11c-الوضعية، المثلث الأزرق = خلايا موجبة CD163. شريط القياس = 100 ميكرومتر.

في كلتا المجموعتين، مع وجود عدد أقل من البلعم المضادة للالتهابات الإيجابية ل CD163 في الأطراف (الشكل 6D). وقد حددت التقييمات الكمية (الشكل 6E) المشهد المناعي بشكل أكبر، حيث أظهرت هيمنة البلاعم M1 (CD11c- إيجابي) على البلاعم M2 (موجبة CD163) في مجموعة BS-Col، مع عدد خلايا بلغ 153.3 ± 29.0 خلية/سم2 و50.0 ± 14.7 خلايا/سم2 على التوالي. على النقيض من ذلك، أظهرت مجموعة BS-Xcol_UVA/R عددا أقل من بلاعم M1 (122.0 ± 30.5 خلية/سم2) وزيادة في حدوث بلاعم M2 (79.9 ± 24.2 خلية/سم2)، مما يشير إلى استجابة التهابية معتدلة.

بحلول اليوم 30، لوحظ تحول ملحوظ في استقطاب البلاعمية. حافظت مجموعة BS-Col على إظهار تعبير قوي من CD11c (173.0 ± 42.1 خلايا/سم2) داخل منطقة الزرعة، مع تعبير ضئيل عن CD163. على النقيض من ذلك، أظهرت مجموعة BS-Xcol_UVA/R زيادة ملحوظة في البلعم المضادة للالتهابات الموجبة ل CD163 (115.0 ± 23.9 خلية/سم2) وإعادة تقليل في تعبير CD11c (76.5 ± 17.9 خلايا/سم2)، كما هو موضح في الشكل 6E. يشير هذا التحول إلى ميل كبير نحو نمط مضاد للالتهاب في مجموعة BS-Xcol_UVA/R، مع خروج واضح عن البيئة المؤيدة للالتهابات المستمرة في مجموعة BS-Col.

يقدم التقييم النسيجي للغرسات تحت الجلد أدلة قوية على فعالية عملية الربط المتقاطع UVA/R في تعزيز الاستقرار الحيوي ودمج مصفوفات الكولاجين ضمن البيئة البيولوجية.   وجود البلاعم الداعم للالتهاب في المرحلة المبكرة، مع الانتقال إلى ملف مضاد للالتهاب في مجموعة BS-Xcol_UVA/R، يمنح استجابة مناعية حادة نموذجية، ضرورية لشفاء الجروح ودمج الزرع. من المرجح أن تساهم نواتج التدهور المنخفضة ووجود الكولاجين المؤكسد (DOPA) بعد علاج UVA/R بشكل تآزري في التأثيرات المضادة للالتهابات. يلعب DOPA، الذي كان أيضا أحد المنتجات في الببتيدات المحتوية على التيروزين بعد معالجة UVA/R (الشكل 3B)، دورا مهما في التخفيف من الالتهابات، مما قد يعزز التوافق الحيوي لهياكل المولدات الكولالية.

يفتح هذا آفاقا لمزيد من الأبحاث حول المواد الحيوية المتشابكة ضوئيا في هندسة الأنسجة والطب التجديدي، لا سيما في فهم واستغلال هذه الآليات لمعالجة المناعة المسيطر عليها في دمج ووظائف الزرعات السريرية. بينما توفر دراستنا رؤى شاملة حول التوافقية الحيوية والخصائص الميكانيكية، يمكن للأبحاث المستقبلية التي تتضمن تحليل التوليد التوافقي الثاني (SHG) أن تقدم فهما إضافيا للتغيرات الفائقة البنية في ألياف جين الكولا، مما يثري استكشافنا للكولاجين الكيميائي الضوئي المتشابك في هندسة الأنسجة والطب التجديدي.

تعزز عملية الربط المتقاطع المحسنة بين UVA/R تكامل سقالات الكوللاجين مع مواد BS، مما يخلق حلا فعالا للغاية لزراعة العظام. هذا النهج المبتكر لا يعزز الاستقرار الميكانيكي الحيوي فحسب، بل يعزز أيضا التوافق الحيوي للمادة المركبة، مما يجعلها مناسبة جدا للتطبيقات السريرية. من خلال دمج الماتريالات غير العضوية في مصفوفة الكولاجين، نعالج الحاجة الأساسية للدعم الميكانيكي المتين، وهو أمر محوري لنجاح تجديد العظام وإعادة تشكيله. والأهم من ذلك، أن طريقتنا تعزز التفاعلات بين الخلايا الأولية والمقالة، وهي عنصر أساسي في هندسة الأنسجة، مع توفير الدعم الميكانيكي الضروري لتجديد العظام.

بعيدا عن تجديد العظام، تمتد مرونة الكولاجين المترابط UVA/R إلى مجموعة واسعة من التطبيقات. يعمل كمادة أساسية لإصلاح الغضروف، حيث قد تكون قدرته على دعم التصاق الخلايا الغضروفية وتكاثرها أمرا حاسما. في شفاء الجروح، فإن توافقها الحيوي الممتاز وبيئتها الملائمة لهجرة الخلايا تسرعان من إصلاح الأنسجة.

في هندسة الأنسجة الوعائية، يدعم هذا الهيكل نمو الخلايا البطانية والعضلية الملساء، وهو أمر ضروري لتكوين الأوعية الدموية الوظيفية.  في تجديد الأعصاب، يمكن للسقالة أن توجه نمو العصابات، مما يوفر طريقا واعدا لإصلاح إصابات الأعصاب. بالإضافة إلى ذلك، فإن معدلات التحلل المصممة خصيصا للمادة وتوافقها مع العوامل البيولوجية المختلفة تجعلها مرشحا ممتازا لأنظمة توصيل الأدوية المستهدفة وأنظمة الإطلاق المسيطر عليها.

لإطلاق الإمكانات الكاملة لهذه المواد في البيئات السريرية، من الضروري فهم أعمق للآليات الأساسية. ستلعب تقنيات التصوير الطيفي المتقدمة دورا حيويا في هذا الاستكشاف، حيث تقدم رؤى حول تفاعل السقالة مع الأنسجة البيولوجية وتأثيرها على سلوك الخلية. يعد هذا الفهم العميق أمرا بالغ الأهمية لتخصيص المواد لتلبية المتطلبات الخاصة لتطبيقات الطب التجديدي المختلفة، لضمان تحقيق أفضل النتائج لإصلاح الأنسجة وتجددها.

3. الخاتمة والنظرة

التفاعل المعقد بين تعقيد جزيء الكولاجين وعملية الربط الضوئي الكيميائي الغامضة للأشعة فوق البنفسجية/الريبوفلافين (UVA/R) هو لغز مثير تمكنت دراستنا من حلها ببراعة. لقد أسفر بحثنا الشامل في آلية الربط المتقاطع للكولاجين باستخدام ستة ببتيدات صناعية مختارة طبقيا رؤى ملحوظة.  تكشف HPLC وLC-MS باستمرار عن تفضيل تاي-روزين بين الأحماض الأمينية، وهو اكتشاف يعزز بشكل كبير فهمنا لتقنية الربط المتقاطع UVA/R المستخدمة على نطاق واسع، خاصة في طب العيون.

يستهدف التيروزين بشكل مسبق الضوء على المسارات الموليكو-لار المحددة المشاركة في تثبيت الكولاجين الناتج عن الأشعة فوق البنفسجية. تؤكد نتائجنا على دور التيروسين في الربط المتقاطع الناتج عن الأشعة فوق البنفسجية، كما أن مجموعة الفينول في التيروزين معروفة أيضا بأنها عرضة للتنشيط الضوئي، مما يوفر استراتيجيات هندسية محتملة للمواد الحيوية الصناعية أو الوظيفية. بعيدا عن توضيح آليات الربط المتقاطع بين UVA/R، أظهرت النتائج دورا حيويا للتيروزين في تصميم وتقييم المواد الحيوية القائمة على الكولاجين، مما دفع إلى إعادة تقييم المواد الموجودة، خصوصا تلك التي تم تعديلها كيميائيا بسبب التيروزين - على الربط المتقاطع الذي يهيمن عليه، مما أثار تساؤلات ذات صلة للمتقدمين والجهات التنظيمية على حد سواء.

كما تدعو الدراسة المقدمة إلى ضرورة إعادة تقييم وتحسين تقنية الربط المتقاطع UVA مع التركيز على تعظيم قابلية التحكم في التفاعل، مثل إدخال بقايا التيروزين المحددة في عملية التفاعل بواسطة ظروف التفاعل المحكمة. من خلال تطوير ببتيدات صناعية تعكس مواقع الربط المتقاطع المحتملة، اكتشفنا التأثير الحاسم لمكافأة التيروزين على آلية التشابك، خاصة تلك الموجودة في المناطق غير الحلزونية الحيوية لتعزيز الخصائص الميكانيكية. لقد أكدت دراساتنا في الجسم الحي على فئران BALB/c التوافق الحيوي والفعالية الوظيفية للكولاجين المترابط UVA/R، مما يؤكد إمكاناته المتفوقة كمادة حيوية للاستخدام العلاجي.

شركة وو شي للأدوية الإضافية المحدودة

المنتجات الرئيسية

بالميتويل إيثانولاميد (PEA) ميكرو (CAS 544-31-0)

سبيرميدين ثلاثي هيدروكلوريد (CAS 334-50-9)

بتيروستيلبين (CAS 537-42-8)

لوتولين (CAS 491-70-3)

فوغليبوز (CAS 83480-29-9) JP GMP

Mailbox:wuxifurther@gmail.com 

واتساب: +86 18036885286